Nos reatores biológicos a transformação é realizada por uma população de microrganismos imersa num caldo nutritivo. No estudo cinético destes processos é necessário acompanhar a evolução da população ao longo do tempo. Em geral este acompanhamento é realizado simultaneamente com o nutriente limitante e o produto desejado. As células podem ser vistas como partículas microscópicas em suspensão no caldo. Por partículas microscópicas entende-se partículas visíveis apenas no microscópio. Nem todas são células vivas e fazer a distinção requer experiência e, principalmente, familiaridade.
No que diz respeito ao estado de agregação as células podem ser isoladas ou aglomeradas formando flocos. Os flocos podem ser visíveis a olho nu se o seu tamanho superar 100 mícrons, mas flocos microbianos invisíveis a olho nu ocorrem. Alguns microrganismos aderem as superfícies sólidas formando filmes. Então quantificar populações microbianas pode ser algo bem complicado.
Existem duas formas de acompanhar a população celular: pesando ou contando. Os resultados devem ser expressos por unidade de volume do caldo fermentante. Por isso, o volume da alíquota coletada deve ser bem determinado e o procedimento conduzido de forma ser possível expressar o resultado por unidade de volume da alíquota.
Os métodos baseados na pesagem são:
Peso centrifugado úmido
Partindo de uma alíquota, as células podem ser separadas por centrifugação. O sobrenadante é separado do decantado o qual é pesado. O resultado é conhecido como peso centrifugado úmido. O parâmetro importante aqui é o tempo de centrifugação e a velocidade de rotação da centrifuga.
Neste método, todas as partículas em suspensão e não apenas células decantam. O decantado é pesado úmido. Tudo isso implica num erro sistemático na medição.
Peso centrifugado seco
Outra forma é levar o decantado para secagem em estufa até peso constante. Este peso é conhecido como peso centrifugado seco. Neste caso, o erro devido ao excesso de umidade praticamente desaparece Aqui surge outros parâmetros importantes, o tempo de secagem para chegar à região de peso constante e a temperatura em que é realizada a secagem. É a técnica de acompanhamento de populações microbianas por pesagem mais usada.
Câmara de Neubauer
Uma forma de contar o número de células é através de microscopia usando uma câmara de Neubauer também conhecida como hemacitômetro. A câmara de Neubauer consiste de uma lâmina de microscopia, bem mais alta do que uma lâmina normal, com marcações em quadrantes, de medidas conhecidas.
Contagem de colônia em placa de Petri
Outra forma de contar uma população microbiana consiste em espalhar uma alíquota de devidamente diluída sobre um meio sólido numa placa de Petri. Se feito corretamente cada microrganismo formará uma colônia visível a olho nu. Contando as colônias obtém-se o número de células.
Turbidometria
As células sendo micropartículas, a presença delas causa turbidez no meio. Isso indica que uma das formas para medir a população é por turbidometria usando um fotômetro. Obviamente uma curva de calibração tem que ser construída. O mais comum é calibrar a atenuação da luz com o peso centrifugado seco ou com a contagem de colônias. A principal vantagem da turbidometria é a rapidez que mais do que compensa o trabalho de construir uma curva de calibração.
Contador Coulter
O contador Coulter é um contador de partículas, não necessariamente de células vivas. É automático, baseado na variação da corrente elétrica na passagem de cada partícula e dá não apenas o número como também os tamanhos das partículas na forma de uma curva de distribuição.
Nenhum comentário:
Postar um comentário